Рентгеновский микроскоп - история, описание, фото

Любое усовершенствование в технике микроскопии открывает перед учеными новые перспективы в познании функционирования живых организмов и природы самой материи. Изобретение оптического микроскопа в конце XVI в. открыло ранее неизведанный мир одноклеточных растений и животных. Развитие рентгеновской кристаллографии в начале ХХ столетия позволило впервые получить отчетливую картину атомной структуры вещества. В последующие десятилетия электронные микроскопы дали возможность наблюдать вирусы и мельчайшие поверхностные структуры. Теперь же микроскоп другого типа, а именно такой, в котором используется рентгеновское излучение, а не свет или электроны, обеспечивает иной способ наблюдения тончайших деталей объекта, позволяющий углубить представления человека об окружающем мире.

Разрешение новых рентгеновских микроскопов значительно выше, чем у оптических приборов. Их можно использовать для построения карт распределения химических элементов. Такие распределения можно получать чрезвычайно быстро, причем имеется возможность построения трехмерных изображений. В отличие от традиционной электронной микроскопии образцы для рентгеновской микроскопии могут находиться на воздухе и в воде, что позволяет изучать биологические объекты в условиях, близких к естественному состоянию. Используемое для «освещения» объекта так называемое мягкое рентгеновское излучение с длиной волны 20-40 А является достаточно проникающим, чтобы давать во многих случаях изображение интактных биологических клеток. Из-за ограничений, накладываемых длиной волны, разрешение микроскопов с мягким рентгеновским излучением не может превзойти наивысшее разрешение электронных микроскопов. Однако их специфические свойства обеспечивают возможность получения информации, во многом дополняющей те сведения, которые получают с помощью оптических и электронных микроскопов.

Идея создания рентгеновского микроскопа зародилась еще в 1895 г., когда Вильгельм Рентген из Вюрцбургского университета открыл неизвестное излучение, названное впоследствии его именем. Способность этого излучения проникать сквозь твердые тела натолкнула на мысль использовать его в микроскопии. Однако ученые вскоре обнаружили, что рентгеновские лучи не испытывают преломления и отражения в той же степени, что и видимый свет. Первые изображения были получены, когда рентгеновские лучи пропускались через объект, приведенный в контакт с обычной фотопленкой. Лучи, прошедшие сквозь объект, экспонировали пленку, и полученное изображение изучалось уже с помощью оптического микроскопа. Эта разновидность рентгеновской микроскопии, известная как контактная микрорадиография, используется и в настоящее время.

В начале ХХ в. было показано, что рентгеновские лучи представляют собой электромагнитные волны, отличающиеся от видимого света значительно меньшей длиной волны. Это открытие дало основание полагать, что с помощью рентгеновского микроскопа удастся получить изображение объекта с весьма высоким разрешением; Предел разрешения оптического микроскопа обусловлен длиной световой волны и составляет примерно 2500 А. у оптических микроскопов, созданных еще 100 лет назад, разрешение уже близко подходило к этому пределу. Биологи пришли к выводу, что для понимания функционирования и организации живых клеток необходимо повысить разрешающую способность приборов и что помочь в этом может рентгеновское излучение с его очень короткими длинами волн.

К сожалению, большой размер зерен эмульсии на фотопленке сильно ограничивает эффективность контактной микрорадиографии. Оптический микроскоп, используемый для изучения изображения на пленке, еще больше ограничивает возможности метода. В результате разрешение первых рентгеновских микроскопов оказалось даже худшим, чем у существующих оптических микроскопов. Исследователи пришли к заключению о необходимости разработки системы фокусировки изображения в рентгеновских лучах. Это оказалось весьма трудной задачей, которая только сейчас находится в стадии решения.

В 1923 г. Артур Комптон показал, что рентгеновские лучи эффективно отражаются хорошо отполированными поверхностями при малых углах падения (так называемых углах скольжения). При наличии поверхности надлежащей формы рентгеновские лучи можно сфокусировать и получить увеличенное изображение аналогично тому, как это делается в традиционных оптических системах. В конце 1940-х годов П. Киркпатрик и руководимая им группа в Станфордском университете попытались построить рентгеновский микроскоп высокого разрешения на основе этого принципа, но им не удалось достичь разрешения выше, чем у оптического микроскопа. Аберрации и недостаточно высокая точность обработки поверхности не позволили реализовать данную схему.

Характеристики рентгеновских микроскопов не поддавались улучшению, а тем временем альтернативный прибор - электронный микроскоп - совершенствовался все более быстрыми темпами. Созданные в 40-е годы прошлого века электронные микроскопы уже превосходил и по разрешающей способности оптические микроскопы, и биологи начали разрабатывать методы приготовления образцов, которые позволили бы полностью использовать представившиеся им возможности. С тех пор электронная микроскопия стала одним из основных методов исследования для целого поколения биологов и способствовала ошеломляющим успехам в понимании строения и функционирования клетки. На какое-то время разработка рентгеновского микроскопа была фактически приостановлена.

Однако в последние годы интерес к рентгеновской микроскопии вновь возрос, главным образом благодаря нескольким важным техническим усовершенствованиям. Наиболее значительное из них - разработка новых источников рентгеновского излучения. Чтобы получить изображение с высоким разрешением, для некоторых типов рентгеновских микроскопов необходимы источники с исключительно высокой яркостью. За последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в усилении яркости рентгеновских источников, основанных на использовании синхротронного излучения (излучения, испускаемого заряженными частицами высокой энергии, ускоренными в магнитном поле).

Яркость, достигнутая сегодня, в миллионы раз превышает яркость рентгеновских трубок, которые на протяжении большей части нашего столетия были единственными источниками мягких рентгеновских лучей. Были также разработаны рентгеновские лазеры и плазменные источники рентгеновского излучения, которые обеспечивают достаточно мощные импульсы излучения для формирования изображения за время, не превышающее 1 нс.

Удалось также значительно улучшить характеристики детекторов рентгеновского излучения. Были разработаны детекторы электронов, а новый материал - фоторезист, -представляющий собой тонкий слой полимера, стойкость которого к травлению меняется при бомбардировке электронами или воздействии рентгеновского излучения, во многих случаях заменил фотопленку. Фоторезисты - удобные, недорогие детекторы рентгеновского излучения.

Другое важное достижение состоит в том, что исследователям наконец удалось сфокусировать рентгеновские лучи с субоптической точностью с помощью «френелевской зонной пластинки». Такие зонные пластинки представляют собой круговые решетки из чередующихся прозрачных и непрозрачных колец, ширина которых уменьшается по мере удаления от центра. Волны дифрагируют при прохождении через прозрачные кольца. При этом различные участки первичного пучка отклоняются таким образом, что все прошедшие через пластинку волны собираются в обшей фокальной точке. Линзы на основе зонных пластинок использовались для фокусировки света, радиоволн, звука и даже нейтронов. В 1960 г. А. Баэз, работавший в Гарвард-Смитсоновской астрофизической обсерватории, предположил возможность фокусировки рентгеновских лучей с помощью такой пластинки.

Изготовление зонных пластинок высокого разрешения сложный технологический процесс. Наивысшее возможное разрешение, достигаемое с помощью пластинки, приблизительно равно минимальному расстоянию между зонами. Следовательно, для получения разрешения, лучшего, чем у оптического микроскопа, надо изготовить пластинку с зонами, расстояния между которыми много меньше длины световой волны. Стандартные технологические процессы изготовления оптических устройств, очевидно, не удовлетворяют этому требованию. Тем не менее, применяя методы, разработанные для изготовления микросхем, исследователи недавно получили пластинки с межзонными расстояниями до 300 А, что составляет приблизительно 1120 длины волны видимого света.

Подход, предложенный Г. Шмалем и д. Рудольфом из Гёттингенского университета, использует приемы ультрафиолетовой голографии (представляющие собой видоизменение тех методик, которые использовались для получения хорошо известных теперь голограмм видимого света) для воспроизведения структуры зонной пластинки на слое фоторезиста. Подход привел к некоторым впечатляющим результатам, однако он ограничен фундаментальным дифракционным пределом: ширина внешней зоны не может быть меньше 500 А .

В другом, более прецизионном методе система зон Френеля «записывается» на фоторезисте с помощью направленного электронного пучка. Методы микротехнологии позволяют преобразовать систему зон на фоторезисте в структуру на золоте, никеле или германии. Электронно-лучевой метод впервые был применен в 1974 г. в исследовательском центре им. Уотсона фирмы EM, где до сих пор изготавливаются тончайшие зонные пластинки в лаборатории Д. Керна (в настоящее время Э. Андерсоном из Научно-исследовательского центра рентгеновской оптики им. Лоуренса в Беркли под руководством Д. Аттвуда). Все приведенные в данной статье микрофотографии получены на сканирующем рентгеновском микроскопе с использованием зонных пластинок, изготовленных этими исследователями. П. Хараламбус, работающий в составе группы Р. Берджа в Королевском колледже в Лондоне, также создал прецизионные зонные пластинки при помощи аналогичного метода. У изготовленных к настоящему времени зонных пластинок с максимальным разрешением ширина внешней зоны составляет от 200 до 300 А.

Зонные пластинки для рентгеновских лучей имеют очень маленькие размеры: их диаметр не более 0,1 мм. Толщина также достаточно мала, так что они наиболее подходят для фокусировки рентгеновских лучей с длинами волн чуть больше 5 А.

Технические совершенствования, введенные за последние несколько лет, позволили увеличить разрешающую способность рентгеновских микроскопов и поднять ее выше предельного значения для оптических приборов. К настоящему времени четыре рентгеновских метода достигли такого уровня: контактная микроскопия, «изображающая» микроскопия, сканирующая микроскопия и голография. Каждый из них имеет свои преимущества.

Контактная микроскопия - наиболее широко применяемый метод. Современная контактная микроскопия отличается от ранее созданной контактной микрорадиографии в двух главных отношениях. Во-первых, фоторезисты (часто - полиметилметакрилат (ПММА), на основе которого изготавливается плексиглас) позволяют достичь более высокого разрешения, чем первоначально использовавшиеся фотопленки. Во-вторых, для наблюдения изображения, образованного на фоторезисте, используются теперь приборы высокого разрешения, в основном электронные микроскопы. На обе эти возможности указал еще в 1956 г. У. Ладд с сотрудниками по фирме Columbian Carbon в Нью-Йорке.

Микроскопия с использованием фоторезиста в качестве детектора впервые была предложена Р. Федером и Э. Спиллером из EM. Хотя контактный метод обладает многими достоинствами, включая относительную простоту и удобство пользования, разрешение контактных изображений ограничивается точностью имеющихся методик считывания изображения, а также дифракционным размытием изображения, представляющим проблему для толстых образцов.

В изображающем рентгеновском микроскопе применяется фокусирующая оптика для формирования изображения, увеличенного в несколько сот раз, которое затем регистрируется детектором со средним разрешением. В устройствах с наивысшим разрешением в качестве линз рентгеновской оптики применяются теперь зонные пластинки. Регистрирующее устройство может быть также фотопленкой, чувствительной к рентгеновскому излучению, или электронным детектором. Группа Шмаля в Гёттингене построила микроскоп такого типа с разрешением около 550 А, в котором используются созданные голографическим методом зонные пластинки. Другие изображающие микроскопы в настоящее время конструируются. в Англии и Японии.

Изображающие рентгеновские микроскопы обладают целым рядом преимуществ. Главное состоит в том, что одновременно освещается и изображается весь образец. Это позволяет быстро получить микрофотографию и таким образом снизить размытие изображения, обусловленное сдвигом, и уменьшить радиационное повреждение биологического объекта. Данный метод также исключает необходимость в усовершенствованных источниках рентгеновского излучения с высокой степенью когерентности. Кроме того, поскольку рассматриваемые микроскопы не имеют движущихся частей, они очень надежны. По этим причинам изображающие рентгеновские микроскопы удовлетворяют требованиям для коммерческой разработки.

Гёттингенская группа показала, как получить изображение, уровень «серого» в котором пропорционален фазовому сдвигу рентгеновского излучения, вызванному прохождением через образец. Изображение с подобным «фазовым контрастом» в конечном счете позволит проявлять большую гибкость в выборе длин волн, снизить дозу облучения и возможно даже достичь более высокого разрешения.

В течение долгого времени контактные и изображающие рентгеновские микроскопы значительно превосходили микроскопы других конструкций по числу полученных микрофотографий. Однако ввиду успешной эксплуатации нескольких новых сканирующих рентгеновских микроскопов ситуация меняется. В сканирующем микроскопе изображение строится поэлементно, во многом так же, как изображение на экране. Процесс начинается с фокусировки рентгеновского пучка при помощи зонной пластинки в кружок малого размера, который охватывает малый участок на образце. Некоторые лучи проникают сквозь образец, и доля первичного пучка, прошедшего сквозь образец, определяет уровень «серого», характерный для данного элемента изображения. Пучок, сфокусированный в кружок, сканирует образец построчно от одной боковой стороны до другой и от верхней границы до нижней, записывая последовательно элементы изображения. Размер кружка определяет разрешение.

Метод сканирования объекта, хотя и представляется медленным и трудоемким, обладает определенными достоинствами. Он удобен для компьютерной обработки изображения и точечного химического анализа. Кроме того, большим удобством является то обстоятельство, что образец может оставаться на воздухе, тогда как рентгеновский пучок почти весь путь проходит в вакууме. Сканирование также минимизирует время воздействия на образец повреждающего излучения. Однако при использовании зонной пластинки для реализации метода необходим когерентный пучок мягкого рентгеновского излучения, который, естественно, можно получить лишь при наличии синхротрона.

Первый сканирующий рентгеновский микроскоп с субоптическим разрешением был создан в 1982 г.  (Киршем), Х. Рарбеком и Дж. Кенни в Университете шт. Нью-Йорк в Стоуни-Брук. Он установлен на Национальном синхротронном источнике (НСИ) в Брукхейвенской национальной лаборатории. Исследователи недавно модернизировали этот микроскоп с целью повышения разрешения и скорости сканирования, с тем, чтобы можно было использовать в качестве источника накопитель с «ондулятором». Это устройство посредством магнитного поля направляет электроны по слегка волнообразной траектории, что вынуждает их излучать узкий рентгеновский пучок с необычайно высокой интенсивностью. При наличии такого пучка микроскоп способен сформировать изображение за время 'около 1мин. Это усовершенствование было введено группой в составе К. Бакли, М. Риверза, Дэмин Шу и др. из Стоуни-Брук, НСИ и Научно-исследовательского центра рентгеновской оптики. Аналогичный микроскоп, построенный группой из Королевского колледжа, работает в Дэрзберийской лаборатории в графстве Чешир (Великобритания); несколько других находятся в стадии конструирования.

Одной из главных целей рентгеновской микроскопии было изучение биологического материала в состоянии, близком к естественному. Для этого требуется, чтобы образцы были интактными и, следовательно, толстыми и трехмерными. При изучении подобных образцов разумно использовать мягкое рентгеновское излучение, поскольку оно обладает проникающей способностью, близкой к требуемой. Исследователей интересует возможность применения рентгеновской голографии - метода, аналогичного тому, с помощью которого изготавливаются зонные пластинки, - для получения трехмерных изображений биологических образцов.

Для трехмерной рентгеновской голографии требуется лучшее разрешение, чем достижимое в настоящее время. Тем не менее, микроскопистам недавно удалось получить детальные двухмерные голографические изображения. Достоинством голографии является то, что, как и для контактной микроскопии, для нее не требуется система фокусировки.

Формирование голографического изображения, впервые предложенное в 1948 г. Д. Гейбором из компании British Thomson-Houston, зависит от того обстоятельства, что свет и другие виды излучения представляют собой волны, взаимодействие между которыми во многом происходит так же, как между волнами на поверхности воды. При наложении двух волн в -некоторых местах совпадают их гребни (волны усиливают друг друга), тогда как в других местах гребень попадает на впадину (волны гасят друг друга). В результате образуется некоторое распределение максимумов и минимумов, когда волна, рассеянная .образцом, налагается на исходный падающий пучок. Гейбор назвал запись такого распределения голограммой. Голограмма хранит информацию как об амплитуде, так и о фазе рассеянной волны, достаточную для восстановления изображения образца.

В 1952 г. Баэз предложил схему безлинзового голографического рентгеновского микроскопа. Физический принцип конструкции Баэза был простым, однако, ее техническая реализация сложной. Для решения этой задачи не подходили ни интенсивности имеющихся тогда когерентных источников рентгеновского излучения, ни разрешающая способность фотоэмульсий. Эти технологические ограничения недавно были преодолены.

Теперь, когда рентгеновские микроскопы вошли в практику исследований, прилагаются усилия для их наиболее полезного применения. Исследователи уже использовали эти приборы для изучения разнообразных объектов: от земляных червей, содержащих тяжелые металлы, до человеческих раковых клеток, от эпидермальных волосиков наперстянки до углей, полупроводниковых устройств и отвердевающего цемента. В настоящее время во многих исследовательских центрах исследуются возможности рентгеновских микроскопов и их применимость для анализа образцов различных типов. Ввиду короткой истории рентгеновских микроскопов высокого разрешения надо про являть осмотрительность при определении того, какие образцы целесообразно исследовать с их помощью.

Результаты, полученные на современных рентгеновских приборах, подтвердили, как и ожидалось, что рентгеновские изображения и электронномикроскопические снимки одного и того же образца различаются. Рентгеновские микроскопы чувствительны к концентрации выбранных элементов (часто углерода и азота), тогда как электронные микроскопы обычно дают картину распределения химических групп в образце, пропитанном создающим контраст красителем. Ни одна из картин не является ложной. Они просто описывают два различных аспекта структуры образца.

Как правило, методы рентгеновской и электронной микроскопии дают Дополняющую друг друга информацию. Электронные микроскопы давно превзошли по разрешающей способности оптические приборы и для многих образцов теперь обеспечивают разрешение от 2 до 20 А . С другой стороны, разрешающая способность современных рентгеновских микроскопов - величина порядка нескольких сот ангстрем, и фундаментальный дифракционный предел (половина длины волны рентгеновского излучения) ограничивает достижимое разрешение.

Ожидается, что главным вкладом рентгеновской микроскопии в исследования будет не выход на новый уровень по разрешению, но скорее количественные измерения биологических объектов без сколько-нибудь существенного их изменения в условиях, очень близких к естественному состоянию. Такие образцы поддаются анализу методом традиционной электронной микроскопии только после их значительного химического или физического изменения. В некоторых случаях влияние препарирования и облучения при записи рентгеновского изображения настолько мало, что образец сохраняет способность реагировать на некоторые внешние раздражители. Для подобных образцов можно получить последовательность изображений, которые позволяют изучить соответствующие реакции и отделить их от эффектов воздействия рентгеновского излучения.

Особенно ценное свойство рентгеновских микроскопов состоит в том, что они могут усиливать либо, наоборот, подавлять видимость определенного элемента в образце. Каждый элемент поглощает рентгеновское излучение избирательно. В интервале длин волн 23-44 А кислород - а значит, и вода - гораздо более прозрачны для излучения, чем органическое вещество. Этот факт открывает возможность контрастного изучения образцов, содержащих воду, которая составляет примерно 3/4 массы большинства клеток. Указанный интервал длин волн рентгеновского спектра, называемый «водяным окном», весьма полезен для биологической микроскопии.

Характер взаимодействия рентгеновского излучения с веществом позволяет про водить подобные количественные измерения плотности и химического состава образцов с помощью рентгеновских микроскопов. Для каждого элемента существуют определенные критические значения энергий рентгеновского излучения, известные как «края поглощения», при превышении которых электрон теряет связь с атомом и переходит в свободное состояние. Только рентгеновское излучение с энергией, большей энергии края, эффективно поглощается. соответствующим элементом. Указанное свойство можно использовать в исследованиях, получая изображения в рентгеновских лучах при энергиях фотонов непосредственно до края поглощения и за ним. Вычитание первого из второго существенно ослабляет сигналы всех элементов, за исключением одного, которому соответствует данный край поглощения. Таким способом с помощью рентгеновского микроскопа можно получить распределение одного элемента в образце.

Проблема радиационного повреждения ограничивает возможные применения как электронной, так и рентгеновской микроскопии. Изменения, вызванные облучением, могут оказаться биологически существенными, даже если они затрагивают только малую долю молекул в клетке. Следовательно, получение изображения с субоптическим разрешением живых клеток с помощью любого вида ионизирующего излучения всегда вызывает заметные биологические изменения в них.

Микроскопист рассматривает радиационные повреждения с иных позиций, чем радиобиолог. Он интересуется прежде всего тем, в какой степени будет искажен тот образ объекта, который он надеется получить при данном разрешении. С другой стороны, радиобиолога прежде всего интересует степень повреждения организма и его различных систем (например, нарушение функции размножения). Однако в любом случае понимание взаимодействия между зондирующим излучением и образцом вопрос сложный. Экспериментальные исследования искажений микрокартины объекта, обусловленных воздействием на него мягкого рентгеновского излучения, находятся пока на самой начальной стадии.

Некоторые специальные приемы, такие как использование излучения с длинами волн, близкими к краю поглощения, позволяют достичь высокого контраста (отношения сигнал/шум) в рентгеновских изображениях. В отличие от их электронно-микроскопических аналогов на них не влияют некоторые фоновые эффекты, например, многократное рассеяние электронов. Более чистый сигнал, обеспечиваемый рентгеновскими методами, позволяет решать определенные микроскопические задачи с меньшими ошибками, связанными с повреждением образца, чем при получении изображений с помощью электронов или других заряженных частиц. Рентгеновское излучение позволяет Формировать изображение в очень быстром (импульсном) режиме и тем самым минимизировать эффекты радиационного повреждения.

Эти преимущества вместе с умеренными требованиям к разрешению в рентгеновской микроскопии по сравнению с электронной микроскопией дают возможность использовать рентгеновское излучение для исследования незащищенных, естественных биологических объектов. Во многих случаях рентгеновские микроскопы позволяют получать изображения, которые не искажены вследствие радиационного повреждения и характеризуются разрешением, намного превосходящим достижимое в оптической микроскопии.

Помимо изучения живых систем рентгеновская микроскопия уже нашла применение в исследовании поверхностей и анализе следов элементов. При изучении поверхностей исследуется не рентгеновское излучение, а электроны, выбитые из атомов вблизи поверхности образца рентгеновскими фотонами. Метод измерения энергии таких электронов, известный как фотоэлектронная спектроскопия, хорошо разработан. Совместный анализ спектроскопических данных и полученного с высоким разрешением рентгеновского изображения даст возможность исследовать распределение элементов на поверхности и анализировать их химическое состояние.

После ста лет исследований развитие технологии изготовления микроструктур наконец-то превратило рентгеновский микроскоп из мечты в реальность. Исследования на рентгеновской аппаратуре в пределах ее возможностей - ценное средство расширения представлений человека об окружающем мире. Мы, оптимисты, надеемся, что научно-технический прогресс будет продолжаться столь же быстрыми темпами и рентгеновские микроскопы оправдают все ожидания ученых.